多細(xì)胞生物的每個(gè)細(xì)胞都攜帶著相同的遺傳學(xué)信息。不過，近年來蓬勃發(fā)展的單細(xì)胞研究告訴我們，每一個(gè)細(xì)胞都是獨(dú)特的。The Scientist雜志近聯(lián)系了單細(xì)胞研究領(lǐng)域的一些專家，請他們分享了在單細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究的秘訣。希望幫助研究者們更好地構(gòu)建文庫，處理和分析結(jié)果數(shù)據(jù)。
那么，細(xì)胞之間的哪些差異有生物學(xué)意義，哪些差異來自于技術(shù)偏好呢?要獲得可靠的結(jié)果又需要研究多少細(xì)胞呢?這些問題曾經(jīng)是單細(xì)胞研究(尤其是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究)的攔路虎，令人望而卻步。單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)和單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析工具在這方面為人們提供了很大的幫助。
The Scientist雜志近聯(lián)系了單細(xì)胞研究領(lǐng)域的一些專家，請他們分享了在單細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究的秘訣。希望幫助研究者們更好地構(gòu)建文庫，處理和分析結(jié)果數(shù)據(jù)。
測序方法大比拼
在單細(xì)胞研究的大潮中，新的測序方法層出不窮。不過，很少有人對這些方法進(jìn)行系統(tǒng)的比對。慕尼黑大學(xué)生物學(xué)家Wolfgang Enard近領(lǐng)導(dǎo)團(tuán)隊(duì)，在小鼠胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)研究中比較了一些常用的單細(xì)胞測序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
Smart-seq
SMART(Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)是一個(gè)具有里程碑意義的重要技術(shù)。實(shí)際上，能夠從單細(xì)胞生成全長cDNA的測序方案并不多，Smartseq就是其中之一。對于等位基因特異性表達(dá)或者剪接變體研究來說，覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)能夠自動(dòng)完成Smart-seq步驟。你只需要將制備好的細(xì)胞懸液加進(jìn)去，儀器就會(huì)分離并裂解細(xì)胞，把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的cDNA可以拿來測序，也可以進(jìn)行qPCR檢測。
在Enard的比較研究中，F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seq為靈敏，成本也高。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復(fù)使用，不過這種芯片可以放到顯微鏡下觀察，證實(shí)健康單細(xì)胞的存在。
斯坦福大學(xué)的學(xué)者Stephen Quake及其團(tuán)隊(duì)利用Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)，對人類大腦皮層的482個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測序，終得到了466個(gè)單細(xì)胞的RNA測序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析表明，單細(xì)胞測序結(jié)果不但能用于區(qū)分神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及血管細(xì)胞，還能將神經(jīng)元分為五類興奮性細(xì)胞和兩類抑制性細(xì)胞。
CEL-seq
CEL-seq(Cell expression by linear amplification and sequencing)是一種采用線性擴(kuò)增的常用測序方法。線性擴(kuò)增的主要優(yōu)勢是錯(cuò)誤率比較低，不過線性擴(kuò)增和PCR都存在序列依賴性偏好。
CEL-seq技術(shù)發(fā)表于2012年，主要是分離單細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段，給它們貼上代表其細(xì)胞來源的條碼。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類似。
CEL-seq和其他線性擴(kuò)增方法生成文庫花費(fèi)的時(shí)間要稍微長一點(diǎn)。不過，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進(jìn)行混合，大大減少了手動(dòng)操作的時(shí)間。PCR是在后階段使用的，主要是為了連接正確的測序接頭。
CEL-seq所需試劑都是現(xiàn)成的，大約兩天時(shí)間生成測序文庫和測序數(shù)據(jù)，Yanai指出。需要注意的是，CEL-seq與大多數(shù)方案一樣，測序轉(zhuǎn)錄本的3’ 端。Enard等人只是在比較研究中用到了CEL-seq數(shù)據(jù)。從這項(xiàng)研究來看，CEL-seq的重現(xiàn)性好。GitHub網(wǎng)站提供有CEL-seq可用的生物信息學(xué)工具。Yanai研究團(tuán)隊(duì)正在開發(fā)新版本CELseq2，新版本的靈敏度將比舊版本高三倍。
SCRB-seq
Broad研究所開發(fā)的SCRB-seq(single-cell RNA barcoding and sequencing)技術(shù)采用的是PCR擴(kuò)增。該技術(shù)需要結(jié)合流式細(xì)胞儀(FACS)或者其他細(xì)胞分選方法，把單細(xì)胞分配到微孔里去。
SCRB-seq與Smart-seq比較相似，只不過SCRB-seq會(huì)整合特異性的細(xì)胞條碼，以分辨擴(kuò)增分子的來源，更準(zhǔn)確的定量轉(zhuǎn)錄本。此外，SCRB-seq并不生成全長cDNA，而是像CELseq一樣富集RNA3’端。
據(jù)說Fluidigm公司的C1系統(tǒng)很快也將支持SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard中意的測序方法，它不僅適用于單細(xì)胞RNA測序，還能支持大量細(xì)胞(bulk)的RNA測序。可惜的是SCRB-seq并不好DIY，研究者自己很難將測序流程與FACS對接起來。
目前，在單細(xì)胞中揭示DNA甲基化與基因表達(dá)的直接關(guān)聯(lián)還比較困難。這是因?yàn)榧?xì)胞之間存在較大的差異，又不能同時(shí)檢測一個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組。加州大學(xué)范國平教授和同濟(jì)大學(xué)薛志剛教授在5月5日的Genome Biology雜志上發(fā)布了自己開發(fā)的新單細(xì)胞測序方法——scMT-seq。這種方法能夠同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組。
滬公網(wǎng)安備31011702889603號 網(wǎng)站地圖