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一、外周血樣本
　　

1. 單細(xì)胞懸液制備實(shí)驗(yàn)原理

　　PBMC(peripheral blood mononuclear cell)，外周血單個(gè)核細(xì)胞，其主要細(xì)胞類(lèi)型為血液中具有單個(gè)核的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞)，單核細(xì)胞，吞噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞和其他少量細(xì)胞類(lèi)型。其中淋巴細(xì)胞占很大一部分。

　　Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400,000，當(dāng)密度為1.2g/ml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過(guò)生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底;淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。
　　

2.單細(xì)胞懸液制備實(shí)驗(yàn)材料

　　全血 (以10ml為例)

　　無(wú)菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水

　　蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)

　　RPMI 1640培養(yǎng)基 (Invitrogen)

　　胎牛血清(FBS)(GIBCO)

　　雙抗P/S (Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)

　　二甲亞砜(DMSO)(SIGMA)

　　預(yù)先裝好異丙醇的凍存盒

3.單細(xì)胞懸液制備操作步驟

　　1.配制所需的溶液：

　　a. 細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S;

　　b. 細(xì)胞凍存液：FBS中加入10%DMSO;

　　2.將10ml全血轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加入10ml PBS溶液稀釋?zhuān)p輕混勻;

　　3.取兩支15ml離心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的ficoll上層，一定要輕柔，避免兩種溶液混合在一起，每只離心管各10ml稀釋血液;

　　4.2,000rpm，20min，注意，降速設(shè)置中一定要設(shè)置成no break，或者只有1-2成的制動(dòng)。離心完畢將得到如圖所示分層;

　

　　5.PBMC所在細(xì)胞層為白色。此時(shí)可以用吸管將該層細(xì)胞吸取在另一干凈的15ml離心管中。

　　6.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min離心后去掉上清，再加入培養(yǎng)基進(jìn)行相同操作的清洗;

　　7.加入5-10ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)或者鋪板;

　　8.細(xì)胞凍存：將細(xì)胞離心收集之后，用細(xì)胞凍存液重懸。取1-1.5ml細(xì)胞至凍存管中，放入凍存盒(凍存盒可事先在4℃冰箱預(yù)冷)。再將凍存盒放置于-80℃冰箱過(guò)夜。第二天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期保存。

　　備注：

　　(1)全血溶液可以加在Ficoll上層或者下層，但是需要保證兩種溶液分層清晰。

　　(2)分離PBMC在離心的時(shí)候，一定不能設(shè)置或設(shè)置低水平的制動(dòng)。否則將分層混亂。

　　二、脫落細(xì)胞樣本

　　在臨床工作中，可以收集到大量自然脫落細(xì)胞，這些細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理，便可成為較好的單細(xì)胞懸液制備供流式細(xì)胞術(shù)分析。主要包括脫落細(xì)胞、胸腹水細(xì)胞、尿液、內(nèi)鏡刷檢細(xì)胞等。

　　(一)食管拉網(wǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備

　　1.將食管拉網(wǎng)器上的細(xì)胞洗脫到20ml PBS液中，以1500r/min離心后，再用PBS液洗2次，離心500~800r/min，1~2min，棄上清;

　　2.再加入PBS液5ml，以300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀去上清;

　　3.加少許PBS液混勻沉淀細(xì)胞，加固定液或低溫保存，備用。

　　(二)尿液脫落細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備

　　1.用以清潔器皿收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀2h，輕輕倒去上清液，留下少許帶細(xì)胞的沉淀物，用吸管移至10~20ml離心管中;

　　2.500r/min離心10min，去上清;

　　3.加PBS液8~10ml，以1000r/min離心10min，去上清，重復(fù)再洗1次;

　　4.再加5ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀去上清;

　　5.再加少許PBS液，混勻。加固定液或低溫保存，備用。

　　(三)胸、腹水脫落細(xì)胞的制備

　　1.抽取胸、腹水50~100ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放鹽水瓶中置于4℃冰箱中靜置6~12h，棄去上清;

　　2.將底部10~20ml用長(zhǎng)吸管移入試管中，用PBS液洗3次，以1500r/min離心沉淀5min;

　　3.再加5ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀去上清;

　　4.加少許PBS液，混勻;加固定液或低溫保存，備用。

　　(四)沖洗液細(xì)胞樣品的制備

　　1.用300~500ml生理鹽水沖洗膀胱，沖洗一定時(shí)間后，吸出沖洗液放入容器中于冰箱內(nèi)置6~12h;

　　2.取沉淀液20~40ml，離心沉淀并以生理鹽水洗2次，吸上清;

　　3.加10ml PBS液，混勻，以300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀去上清;

　　4.過(guò)濾后1000r/min，10min，離心沉淀，去上清;加固定液或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>